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    公开号:WO1992006211A1
    申请号:PCT/JP1991/000239
    申请日:1991-02-25
    公开日:1992-04-16
    发明作者:Hiroaki Yamamoto；Kunihiko Yamashita
    申请人:M & D Research Co., Ltd.；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明細書 ぺプチ ド又は蛋白質の製造方法 技術分野
    [0002] 本発明は、 遺伝子組換え技術を利用して、 宿主によりべプチ ド又 は蛋白質を融台蛋白質と して生産した後、 特異的なプロテアーゼな どを作用させて、 ぺプチ ド又は蛋白質を生産するべプチ ド又は蛋白 質の製造方法に関する。 背景技術
    [0003] 遺伝子組換え技術を利用して、 異種のペプチ ドや蛋白質を生産す る場合、 目的遣伝子産物を直接発現させても、 大量生産できない場 合が多い。 その理由として、 開始コ ドン近傍の m R N Aの高次構造 の影響により、 目的遣伝子の翻訳開始反応が阻害されること [ D . I serent ant , E . F i ers , Gene . 9 , 1 ( 1 980) ] 、 目的遺伝子産物が 低分子量である場合には、 特に宿主由来のプロテア一ゼにより分解 され易いことなどが指摘されている。
    [0004] これらの問題を解決する方法と して融合蛋白質法が注目されてい る。 この融合蛋白質法では、 宿主内で安定でかつ多量に生産される ぺプチ ド又は蛋白質などのキヤ リア一と、 目的とするぺプチ ド又は 蛋白質とを融合させて生産する。 なお、 この融合蛋白質法には、 一 般的な蛋白質の範疇、 すなわちア ミ ノ酸数が 5 0未満のキャ リ アー を用いる場合も含まれる。 また、 融合蛋白質として直接発現させる 場合にも、 宿主内のメ チォニンア ミ ノぺプチダ一ゼによるプロセシ ングが不完全であるため、 開始コ ドンに由来するメチォニンが、 完 全には除去されずに残存し、 N末端にメチォニンが付加した目的遣 伝子産物が得られる場台が多い。 このメチォニンが付加した遺伝子 産物は、 抗原性に問題が生じる可能性が指摘されている （特開昭 6 2 - 1 7 1 6 9 9号公報） 。 従って、 このような融合蛋白質ゃメチ ォニンが付加した遺伝子産物から目的とするぺプチ ド又は蛋白質を 得るためには、 融合蛋白質等から目的とする部分のみを切りだす必 要がある。 この切りだし方法として、 従来、 化学的な方法と、 酵素 的な方法が知られて'いる。 - 化学的な方法としては、 例えば、 臭化シアンによる M e t の C末 端側の切断 [D. V. Goeddel , et al .. Proc. Natl . Acad. Sci . US A 76. 106-110 (1979)] 、 B N P S —スカ トール（Skatol )や N—ク ロロスク シンイ ミ ド （N C S ) による T r pの C末端側の切断 [Y. Saito, et al., J. Biochem. 101 , 123-134 (1987)] 、 7 0 %ギ 酸などの酸による A s p — P r o間の切断 [Biochem. Biophys. Re s. Commun. , 40, 1173 (1970) ] 、 ヒ ドロキシァ ミ ンによる A s n - G 1 y間の切断などが知られている。
    [0005] しかしながら、 基質融合蛋白質の構造依存性が強いため、 臭化シ アンによる切断を除いて、 切断反応による収率は低く、 副反応も生 じ易い。 臭化シアンによる切断は広く利用ざれているが、 目的とす る遺伝子産物中に M e tが存在する場合には、 利用できないだけで なく 、 M e t の次のア ミ ノ酸が S e r、 T h rである場合には、 殆 ど切断反応が起らない場台がある。 また、 A s p — P r o間、 A s n - G 1 y間を切断する場合には、 切断後に生成するべプチ ド又は 、蛋白質の N末端側及び C末端側の双方にァ ミ ノ酸が残存するため、 切断により、 N末端、 C末端に目的とするア ミ ノ酸配列を有する遺 伝子産物を得るのが困難である。
    [0006] 酵素的な方法として、 切断されるべプチ ド锆合の前（P1 位） 又は 後（ΡΓ位） のア ミ ノ酸に対する特異性、 すなわち、 1次特異性の厳 密なプロテアーゼを利用した切断方法、 例えば、 ト リプシン、 ェン ドプロティナーゼ A r g— Cなどの ト リプシン様酵素による A r g、 L y sの C末端側の切断 [J. Shine, et al .. Nature, 285 , 456- 461 (1980)] 、 リ ジルエン ドべプチダーゼ、 エン ドプロティナーゼ L y s — Cなどによる L y .sの C末端側の切断 （特開昭 6 1 - 2 7 5 2 2 2号公報） 、 酸性ア ミ ノ酸に特異的な V 8プロテアーゼなど の酵素による G 1 u、 A s pの C末端側の切断 （特公表昭 6 0— 5 0 1 3 9 1号公報） などが知られている。
    [0007] しかしながら、 これらのプロテアーゼは、 一般に、 その認識アミ ノ酸が目的遣伝子産物に含まれていない場合にのみ有効であり、 非 常に限定された遣伝子産物にしか適用できない。
    [0008] 1次特異性だけでなく、 切断されるぺプド結合周辺の配列に対す る特異性、 すなわち 2次特異性が厳密な酵素も利用されている。 例 えば、 コラゲナ一ゼによるチキンプロ（chicken pro) -2 コラ一 ゲン（col lagen)や P r o - X - G 1 y — P r oの X— G l y間の切 断 [特公昭 6 2— 44 9 2 0号公報、 J. Germ i no, et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 81, 4692-4696 (1984)] 、 血液凝固因子 X aによる I l e — G l u — G l y — A r gの C末端側の切断 （特開 昭 6 1 — 1 3 5 5 9 1号公報） 、 卜ロ ンビン（Thrombin)による G 1 y — P r o — A r gなどの C末端側の切断 （特開昭 6 2— 1 3 5 5 0 0号公報） 、 カ リ ク レイ ン（Kallikrein)による P h e — A r gの C末端側の切断 （特開昭 6 2 - 248489号公報） 、 ェンテロべ プチダ一ゼ (Enteropeptidase) による V a 1 — A s p — A s p — A s p — A s p — L y s の C末端側の切断 [T. P. Hopp, .et al .■ Bi otechnology, 6 , 1204-1210 (198 及び特開昭 5 6— 1 66 2 0 0 号公報] 、 レニン（renin) による P r o— P h e — H i s — L e u 一 L e u — V a 1 — T y rの L e u — L e u間の切断 （特開昭 6 0 - 26 2 5 9 5号公報） 、 リ ゾスタフイ ン（し ysostaphin) によるポ リ （poly)— G 1 yの C末端側の切断 （特開平 1 — 1 6 04 9 6号公 報） 、 ュビキチン（Ubiquitin) — N α —プロティ ン ヒ ドロラーゼ（ρ rotein hydrolase) によるュビキチン（Ubiqui Un) の C末端側の切 断 [T. . Butt . et al . , Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA. 86, 254 0-2544 (1989) ] 、 ゥ口キナーゼ（uroki nase〉 による G 1 u — G 1 ,
    [0009] 4
    [0010] y— A r gの C末端側の切断 （特開平 2— 1 0 0 68 5号公報） な どが報告されている。
    [0011] しかしながら、 コラゲナーゼ、 レニンによる分解では、 切断部位 の N末端側及び C末端側の双方にぺプチ ドが残存するため、 目的と するアミ ノ酸配列を有する遣伝子産物を得るのが困難である。 トロ ンビンを始めとする多くの酵素は、 その認識配列以外の部位をも切 断することが報告され、 特異性が低いので汎用性に欠ける [J. Y. Chang. Eur. J. Biochem. 151, 217-224 (1985)など] 。 融合蛋白 質から目的遺伝子産物を切りだすため、 血液凝固因子 X aは、 現在 最も広く利用されているが、 特異的認識配列以外の部位をも分解す るため、 目的遣伝子産物が得られない例が報告されており [S. Nis hikawa. et al .. Protein Engineer. 1 . 87-492 (1987)など] 、 汎闭性に欠ける。 例えば、 血液凝固因子 X a、 カリ ク レイ ンを用い て、 融合蛋白質から、 目的遺伝子産物として、 バソアクティ ブ · ィ ンテスティ ナノレ ♦ ポリペプチ ド [Vasoactive I ntest i nal Pol y pep t ide ( 以下、 V I Pと略称する） ] 誘導体を切.りだす場合には、 V I P内部、 例えば、 A r g 14— L y s間などで切断が生じるため、 V I P誘導体は得られない。 さらに、 これらのプロテアーゼの使用 量は、 基質融合蛋白質 1モルに対して、 0. 1〜 0. 0 0 1 モル、 通常 0. 0 1 モル程度であり、 かなりの酵素量を必要とする。
    [0012] 一方、 キャ リ ア一配列と、 目的遺伝子コー ドする D N A配列とを、 ジぺプチ ドからなるプロセシングシグナルを介して連結し、 融合蛋 白質を生産し、 前記ジぺプチ ド.を酵素的に切断することにより、 目 的遺伝子産物を取得する方法も知られている。 例えば、 前記ジぺプ チ ド、 特に塩基性ァ ミ ノ酸残基対を利用した目的遺伝子産物の取得 方法として、 酵母サッカロマイセス · セレビジェ （Saccharomyces cerevisiae) の生産する α—接合因子のプレプロリーダー配列 ( L y s — A r gを含む） を利用して目的遺伝子産物を分泌生産す る方法 （特開昭 5 9— 1 3 289 2号公報） やクライべロマイセス プ ラ ク ティ ス （Kluyveromyces 丄 actis) の ひ —接合因子のプレブ 口 リ—ダー配列を利用して目的遺伝子産物を分泌生産する方法 （特 開平 1 — 1 24 3 9 0号公報） などが報告されている。 これらの方 法では、 融合蛋白質がイ ンビボ（in vivo) で限定分解された後、 目 的遣伝子産物が菌体外に分泌生産される。
    [0013] しかしながら、 これらの方法は、 特殊な宿主、 例えば、 塩基性ァ ミ ノ酸残基対における切断、 分泌、 糖鎮の付加などのプロセシ ング システムを有するサッカロマイセス · セレビジェ、 クライべ口マイ セス ♦ ラクテイ スや動物細胞 A t T— 2 0 cel l lineなどを用いた 場合にのみ利用可能であり、 一般的な方法ではない。 また、 これら の系を用いる場台には、 プロセ シ ングが不完全な遣伝子産物、 すな わち、 プレブ口 リーダ一配列に由来する G 1 u — A 1 a配列などが 付加された遺伝子産物が生成すること （特開昭 5 9 — ： 1 3 28 9 2 号公報、 特公表昭 6 2 - 5 0 2 6 6 1号公報など） 、 各種のプロテ オ リ シス、 グリ コ シ レー シ ヨ ンなどのプロセ シ ングの様々 なステ ツ プが律速となるため、 生産効率が一般に低、 、 生産量が少ないなど の問題がある。 発明の開示
    [0014] 従って、 本発明の目的は、 汎用性があり、 大量処理が可能なぺブ チ ド又は蛋白質の製造方法を提供することにある。 - 本発明の他の目的は、 広い範囲の宿主微生物により異種の融^蛋 白質を生産させ、 特異性の強い酵素により、 融合蛋白質から目的遣 伝子産物を効率よ く 切りだすことができるペプチ ド又は蛋白質の製 造方法を提供することにある。
    [0015] 本発明のさらに他の目的は、 融合蛋白質を生産した後、 イ ンビト 口（in vitro)で分解するべプチ ド又は蛋白質の製造方法を提供する ことにある。
    [0016] 本発明は、 多く の生理活性ペプチ ドや蛋白質が、 L y s - L y s、 a
    [0017] 6
    [0018] A r g— L y s、 L y s — A r g、 A r g— A r gなどのジぺプチ ドをプロ シングシグナルとし、 前駆体からペプチ ド又は成熟型蛋 白質へとプロセシングされることから、 多く の生理活性べプチ ド及 び成熟型の蛋白質内には、 これらのジぺプチ ドが存在しない場台力 多い点に着目してなされたものである。 本発明では、 これらのプロ セシングシグナルであるジぺプチ ドをコ一 ドする塩基 ¾E列を、 キャ リア一と、 目的遺伝子産物をコー ドする D N A断片との間に挿入し、 宿主微生物により、 目的遺伝子産物を融合蛋白質として生産する。 . 融合蛋白質に、 前記ジぺプチ ドを特異的に認識し、 かつジぺプチ ド の C末端側、 N末端側、 またはジペプチ ド間を特異的に加水分解す るプロテアーゼ ； または前記プロテア一ゼと、 N末端側から特異的 に塩基性ァミ ノ酸残基を遊離するァ ミ ノべプチダーゼや、 C末端側 から特異的に塩基性ァ ミ ノ酸残基を遊離する力ルポキシぺプチダー' ゼとを適当に組台わせて作用させる場合には、 目的とするぺプチ ド 又は蛋白質が成熟型で得られることを見いだした。 すなわち、 本発 明は、 下記式 [ I a ] 又は [ I b ]
    [0019] A - B - C [ l a ]
    [0020] C - B - A [ l b ]
    [0021] [式中、 Aは、 キャ リ アーを示し、 Bは、 酵素的に切断可能な Χ ι - X 2 ( X I は、 Aの C末端に結合した L y s、 A r g又は P r o を示し、 X2 は、 Cの N末端に結合した L y s又は A r gを示す。 但し、 X i が P r oであるとき、 X2 は A r gである） で表される ジペプチ ドを示す。 Cは目的とするペプチ ド又は蛋白質を示す] で 表される融合蛋白質を宿主微生物により生産した後、 少なく とも、 前記ジペプチ ドを特異的に認識し、 かつジペプチ ドのペプチ ド結台 を特異的に加水分解するプロテアーゼで処理するぺプチ ド又は蛋白 質の製造方法を提供する。
    [0022] また、 本発明は、 少なく とも、 下記式 [ π ] 又は [m]
    [0023] ~ B— c n [ π ] - c - n [m]
    [0024] [式中、 Bは酵素的に切断可能な X I - X 2 (Χ ι は、 L y s、 A r g又は P r oを示し、 X2 は、 L y s又は A r gを示す。 但し、 X I が P r oであるとき、 X 2 は A r gである） で表されるジぺブ チ ドを示す。 Cは目的とするペプチ ド又は蛋白質、 nは 2以上の整 数を示す] で表される単位を含む融合蛋白質を宿主微生物により生 産した後、 少なく とも、 前記ジぺプチ ドを特異的に認識し、 かつジ ぺプチ ドのぺプチ ド結合を特異的に加水分解するプロテア一ゼで処 理するぺプチ ド又は蛋白質の製造方法を提供する。
    [0025] なお、 本明細書において、 キャ リ アーとは、 Aと Bとの間に介在 するスぺーサ一、 ペプチ ドなども含む意味に用いる。
    [0026] キャ リア一には、 例えば、 黄色ブドウ状球菌 [スタフイ ロコッカ ス · ァウ レウス (Staphylococcus aureus) ] 由来のプロテイ ン Aな どが含まれ、 目的ペプチ ド又は蛋白質には、 例えば、 バソァクティ フ " ♦ イ ンテスティ ナノレ · ポ リ ペプチ ド、 [Vasoactive Intestinal Po lypeptide (V I P ) ] 前駆体などが含まれる。
    [0027] プロテアーゼは、 単独で使用してもよく 、 融台蛋白質の構造およ びプロテア一ゼによるジぺプチ ドの切断部位に応じて、 ぺプチ ド鎖 の N末端側から塩基性ア ミ ノ酸のみを特異的に遊離するア ミ ノぺブ チダ一ゼ及び/又はぺプチ ド鎖の C末端側から塩基性ァ ミ ノ酸を特 異的に遊離するカルボキシぺプチダ一ゼと組合せて使用してもよい c ジぺプチ ドを特異的に加水分解するプロテア一ゼには、 例えば、 酵母サッカロマイセス属 （Saccharomyces) などに由来する酵母由 来の塩基性ァ ミ ノ酸残基対特異的プロテアーゼなどが含まれる。 ま た、 ア ミ ノぺプチダ一ゼには、 ア ミ ノぺプチダ一ゼ B (E . 3.4.11 .6) などが含まれ、 カルボキシぺプチダーゼには、 例えば、 カルボ キシぺプチダーゼ B (E.C. 3.4.17.2) 、 カルボキシぺプチダーゼ E (エンケフア リ ン · コ ンベルタ一ゼ） 、 カルボキ シぺプチダ一ゼ N (B.C. 3.4.17.3) 、 及び yscひ などが含まれる。 g
    [0028] 宿主微生物には、 例えば、 ェシリ ヒア （Escherichia) 属、 バチ ノレス （Bacillus) 属、 又はスタフイ ロコッカス (Staphylococcus) 属微生物などが含まれる。
    [0029] なお、 従来、 塩基性 T ミ ノ酸残基対に特異的なプロテアーゼを、 異種の宿主により生産した融合蛋白質に作用させて、 目的とする遣 伝子産物を得た報告は存在しない。
    [0030] また、 本発明には、 適当な化学修飾法、 例えば L y sの無水シ ト ラコン酸による可逆的修飾などとの組合せによるペプチ ド又は蛋白 質の製造方法も含まれる。
    [0031] 本明細書においては、 ペプチ ドは、 通常の配列記載方法に従って、 左側を N末端側、 右側を C末端側とする。
    [0032] 本発明のこれらの目的及び利点は、 以下の詳細な説明を参照する ことにより、 よりょく理解されるであろう。 図面の簡単な説明
    [0033] 第 1図はプラ スミ ド P MD 2 0 0の構築図 ；
    [0034] 第 2図はプラ スミ ド p MD 3 2 1 aの構築図 ；
    [0035] 第 3図はプラ ス ミ ド p MD 3 2 1 R 5 aの構築図 ；
    [0036] 第 4図はプラ ス ミ ド P MD 5 0 0 R 5の構築図 ；
    [0037] 第 5図（A)(B)は実施例 1 における反応液の逆相高速ク口マ トダラ ' フィ 一による溶出パターンを示すクロマ トグラム ；
    [0038] 第 6図（A)(B)は実施例 2における反応液の逆相高速クロマ トダラ フィ 一による溶出パターンを示すクロマ トグラムである。 発明の詳細な説明
    [0039] キャ リア一 Aは、 宿主微生物により菌体内、 菌体外、 ペリプラズ ム内に生産されるぺプチ ド又は蛋白質である限り、 制限されないが、 ジペプチ ド X， 一 X 2 が存在しないのが好ま しい。 このようなキヤ リア一 Aと しては、 例えば、 ひ—ア ミ ラーゼ、 中性又はアルカ リ性 プロテア一ゼ、 セルラーゼ、 S —，ラ ク タマ一ゼ、 ーガラ ク ト シダ ーゼ、 ク ロラムフエニコ一ノレァセチル トラ ンスフェラ一ゼ、 R e c A蛋白質、 t r p E、 ヒ トイ ンタ一ロイキン一 2、 ヒ ト成長ホルモ ン、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素、 プロテイ ン A、 λ c ϊ I 、 アルカ リ フ ォ スファタ一ゼ、 ぺニシリナーゼなどの全部又はその一部 ； これら の誘導体が挙げられる。 前記誘導体には、 C y sが除去又は置換さ れたもの、 C y s を付加したもの、 ジペプチ ド X I — X 2 などの内 在配列を除去したものなどが含まれる。
    [0040] キャ リアー Aは、 場合によっては、 ア ミ ノ酸であってもよい。 ま た、 キヤ リ ア一 Aには、 開始 ドンに由来する M e t のみを目的遣 伝子産物の直前、 又は 1 〜数十のア ミ ノ酸を介して、 プロセシング シグナルの N末端側に結含した融合蛋白質をコ一 ドする配列も含ま れる
    [0041] 好ま しいキャ リ ア一には、 黄色ブ ドウ状球菌 [スタフイ ロコ ッカ ス · ァウ レウス（Staphylococcus aureus) ] 由来のプロテイ ン Aな どが含まれる。 黄色ブドウ状球菌のプロテイ ン Aには、 遺伝子の発 現に関与するプロモータ一、 リボソーム結合部位、 分泌シグナル及 びタ ンパク質をコー ドする領域が含まれている。
    [0042] プロテアーゼと しては、 ジペプチ ド X i - X 2 、 すなわち、 L y s — L y sゝ A r g — L y s、 L y s - A r g > A r g - A r g X は P r o — A r gを特異的に認識し、 かつ、 ジペプチ ドの C末端側、 N末端側またはジぺプチ ド間における特異的な加水分解を触媒する プロテアーゼである限り、 その起源を問わず使用できる。
    [0043] L y s - A r g s A r g — A r g、 A r g — L y s、 L y s - L y s 間を特異的に加水分解するプロテアーゼと しては、 大腸菌 （ cherichia col i) 由来の O m p Tプロテア一ゼ [プロテア一ゼ W， K. Sugimoto, et al . , J. Bacteriol .170 , 5625-5632 (1988)] 、 サノレモネラ ♦ ティ フィ ム リ ウム (Salmonel 1 a typhi murium ) 由来 の E — Protein C J . Grodberg and J . J. Dunn. J . Bacteriol . 17 1 . 2903-2905 (1989)] 、 鎮痛ペプチ ドの生台成に関与するプロテ ァ一ゼ [ . Demmer and K . Brand . Biochem . Biophys . Res . Cominu n.. 138, 356-362 (1986)] などが挙げられる。
    [0044] A r g— L y s、 A r g - A r gの N末端側を特異的に加水分解 するプロテアーゼとしては、 例えば、 ソマ トスタチンの成熟に関与 するプロテア—ゼ [P. Gluschankof . et al .. J . Biol . Chem.262 , 9615-9620 (1987)] などが挙げられる。
    [0045] L y s — A r g、 A r g— A r gの C末端側を特異的に加水分解 するプロテアーゼとしては、 例えば、 I R CM—セリ ンプロテア一 ゼ（Serine Protease) 1 [J. A. Croml ish, et al . , J. Biol . Che m.261. 10850-10858 (1986)] 、 P 0 M C—コ ンバーティ ングェン ザィム (converting enzyme) [ Y . P. Loh , et al .. J . Biol . Chem . 260, 7194-7205 (1985)] 、 酵母サッカロマイセス属 [Saccharo niyces, K . Mizuno. et al .. Biochem . Biophys . Res . Commun. 1 44. 807-814 (1987)] 、 クライべロマイセス属 （ K 1 uy veromyces) 、 スポロボロマイ セス属 (Sporobolomyces) 、 フ-イ ロノ ジジゥム属 (Fi lobasidium) 、 ハンゼヌラ属 （Hansenula) 、 ィサチェンキア 属 （ Issatchenkia) 、 ピキア厲 （Pichia) 、 ロ ドスポリ ジゥム属
    [0046] (Rhodosporidium) 、 サッカロ ミ コフ シス属 ( Saccharom cops is) 由来のプロテア—ゼ （特開平 1 — 1 9 1 683号公報、 特開平 2 - 4 9 58 5号公報） などが挙げられる。
    [0047] 多くの生理活性べプチ ドゃ蛋白質が L y s — A r g、 A r g— A r の C末端側における加水分解を受けて成熟型にプロセシングさ れる。 従って、 L y s — A r g、 A r g - A r gを特異的に認識し、 かつその C末端側における加水分解を触媒するプロテアーゼが特に 好ま しい。 さらに好ま しいプロテア一ゼは、 酵母由来の塩基性アミ ノ酸残基対特異的プロテア一ゼであり、 このプロテアーゼは、 L y s — A r g、 A r g— A r g (又は P r o — A r g ) のじ末端側を 特異的に加水分解し、 A r g— L y s、 L y s — L y s配列を切断 しないこと、 酵母起源であるため大量に調製することが比較的容易 であること、 一般に安全性が高いことなどの理由から、 特に好ま し い。
    [0048] プロテアーゼは、 ジペプチ ドを特異的に認識し、 かつジペプチ ド の C末端又は N末端を特異的に加水分解し、 目的ペプチ ド又は蛋白 質を与える場合には、 単独で使用できる。
    [0049] また、 プロテアーゼは、 融合蛋白質の構造およびジペプチ ドの切 断部位に応じて、 ジぺプチ ドの N末端から塩基性ァ ミ ノ酸を遊離す るァ ミ ノぺプチダーゼ及び 又は C末端から塩基性ァ ミ ノ酸を遊離 するカルボキシぺプチダーゼと組合せて使用してもよい。
    [0050] 塩基性ァ ミ ノ酸を特異的に認識し、 'ジペプチ ドの C末端側又は N 末端側から塩基性ァ ミ ノ酸を遊離するカルボキシぺプチダーゼ又は ァ ミ ノぺプチダーゼは、 このような特異性を有する酵素であれば、 その起源を問わず使用可能である。 カルボキシぺプチダ一ゼ、 ア ミ ノぺプチダ一ゼと しては、 例えば、 カルボキシぺプチダーゼ B (E . C. 3.4.17.2)、 カルボキシぺプチダーゼ E (エンケフア リ ン · コ ン ベルタ一ゼ） 、 カルボキシぺプチダ一ゼ N (E. C. 3.4.17.3)、 ysc a [サッカロマイセス * セレビジァェ由来の K E X : 遺伝子産物； A,-Dmochowska, et a , Cel 1 ,50. 573-584 (1987)] 、 ア ミ ノぺプ チダ一ゼ B (E. C. 3.4.11.8)などが挙げられる。
    [0051] 目的とするペプチ ド及び蛋白質 Cは、 特に踉定されない。 ぺプチ ド及び蛋白質 Cには、 例えば、 イ ンス リ ン、 ガス ト リ ン、 各種^ピ オノィ ドぺプチ ド、 上皮細胞成長因子、 エン ドセリ ン、 V I P、 心 房性利尿ホルモン （ A N P ) 、 サブスタ ンス P、 カ ノレシ トニン、 ィ ンシュ リ ン様成長因子 I , I I 、 ガラニン、 モチ リ ン、 バソプレシ ンなどの各種の生理活性べプチ ドまたはこれらの前駆体 ； ヒルジン、 ェグリ ン C、 分泌性白血球由来プロテアーゼィ ンヒ ビ夕一などの阻 害剤、 ヒ トアルブミ ン、 血液凝固因子、 リ ンフ ォカイ ン、 神経成長 因子、 肝細胞再生因子などの各種の分化誘導因子、 成長因子などの 蛋白質またはこれらの前駆体が含まれる。
    [0052] 好ま しいべプチ ドには、 V I P前駆体が含まれる。 V I Pは 28 個のアミ ノ酸残基からなり、 血管拡張作用や血流増加作用などの薬 理作用を有する [Science 169, 1217 (1970)] 。 V I Pは、 下記の ァミ ノ酸配列で表される。
    [0053] H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Th*r-Arg- Leu— Arg— Lys— Gl n— Met— Al a— Val—し ys—し ys— Tyr— Leu— Asn— Ser— 11 e-Leu-Asn-NH2
    [0054] このア ミ ノ酸配列で表される V I Pは、 1 7番目のァミ ノ酸が L e uではなく M e tである点で、 先行技術文献 [特開平 1 一 2 96 99 6号公報および Eur. J. Biochem. 178, 343-350 (1988)] に記 載の V I Pと異なる。
    [0055] 前記 V I P前駆体は、 下記のァ ミ ノ酸配列で表されるように、 V' 1 のじ末端に 0 1 ー が付加したものでぁる （以下、 V I P— G 1 yという） 。
    [0056] H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg- し eu— Arg—し ys— Gl n— Met— Al a— Val—し ys—し ys— Tyr— Leu— Asn— Ser— I le-Leu-Asn-Gl -X
    [0057] (式中、 Xは、 O H、 L y s — O H、 A r g— O H、 L y s - A r g— O H、 または A r g— L y s — O Hを示す）
    [0058] 本発明の 1つの態様において、 融合蛋白質は、 下記式 [ I a ] 又 は [ l b ] で表されるように、 前記キャ リ アー Aと、 目的とするぺ プチ ド又は蛋白質 Cとが、 酵素的に切断可能なスぺーサー配列 B、 すなわちジペプチ ド Xi — X2 を介して結合し、 かつ宿主微生物に より生産可能であればよい。
    [0059] A— B— C [ l a ]
    [0060] C - B - A [ l b ]
    [0061] 融合蛋白質の構造が A— B— C [ I a ] である場台には、 Bを認 識してその C末端側を特異的に加水分解するプロテアーゼを、 C _ B - A [ I b ] である場台には、 Bを認識してその N末端側を特異 的に加水分解するプロテア一ゼを作用させ、 目的とするぺプチ ド又 蛋白質を得ることが好ま しい。
    [0062] また、 塩基性ア ミ ノ酸残基対を特異的に認識し、 その N末端側、 C末端側、 又はその間を加水分解する適当なプロテアーゼと、 適当 なェキソぺプチダーゼとを組合せて目的物を得ること'もできる。 例 えば、 A— B— C [ I a ] の構造を有する融合蛋白質に、 Bを認識 し、 その N末端側又はその間で特異的に加水分解するプロテア一ゼ と、 ぺプチ ドの N末端側から塩基性ァ ミ ノ酸のみを特異的に遊離す るア ミ ノぺプチダ一ゼとを共同して作用させることにより、 目的物 を得ることもできる。 また、 C— B - A [ l b ] の構造を有する融 合蛋白質に、 Bを認識し、 その C末端側、 またはその間で特異的に 加水分解するプロテア一ゼと、 ペプチ ド鎖の C末端側から特異的に 塩基性ァ ミ ノ酸を遊離するカルボキシぺプチダ一ゼとの共同作用に より、 目的物を得ること もできる。
    [0063] さ らに、 目的遺伝子産物が、 例えばァ ミ ノ酸数が 1 00個以下の 比較的低分子量のぺプチ ドである場台には、 その生産量、 生産性を 高めるため、 キャ リ ア一に、 目的ペプチ ドが複数連結したタ ンデム 型融合蛋白質と して生 する試みがなされている。 タ ンデム型融合 蛋白質法により目的遺伝子産物を得るには、 目的ペプチ ドを適当な スぺ一サを介して結合させ、 融合蛋白質からスぺ一サーを完全に除 去しなければならない。 このタ ンデム型融合蛋白質法に関して、 例 えば、 L y s を含まないペプチ ド （心房性ナ ト リ ウム利尿ペプチ ド、 A N P ) を、 L y s — S e r — S e r — L y s を介して結合した夕 ンデム型融合蛋白質を生産した後、 リ ジルエン ドべプチダーゼ、 力 ルボキシぺプチダーゼ Bの作用により、 目的べプチ ドを得ること力《 報告されている [M. Lennick, et al . , Gene. 61, 108-112 (1987)] 。 しかしながら、 このような方法は、 L y s を含有しない目的ぺブ チ ドにしか適用できず、 汎用性に欠ける。 また、 同様ないく つかの 方法が報告されているが （特開昭 6 2 - 2 2 6 9 9 8号公報、 特開 昭 6 3— 7 1 1 9 5号公報など） 、 これらの方法は、 前記と同様に、 汎用性に欠けること、 多段階の反応を必要とすること、 スぺーサー の長さが大きいことなどの種々の問題がある。
    [0064] 本発明の方法は このような夕.ンデム型融合蛋白質法により目的 ぺプチ ドを生産する場合にも、 極めて有用である。 ずなわち、 Xi - X 2 で表されるジぺプチ ド Bを目的べプチ ド間に挿入したタンデ ム型融 蛋白質を生産した後、 ジぺプチ ドに特異的なプロテアーゼ と、 塩基性ァ ミ ノ酸に特異的なァ ミ ノぺプチダーゼ、 力ルポキシぺ プチダーゼとを組台せて作用させることにより、 成熟型のぺプチ ド を効率よく多量に得ることができる。
    [0065] なお、 特殊な場台と して、 目的とするペプチ ド又は蛋白質の C末 端ァミ ノ酸が P r oである場台には、 スぺーサとして A r gを揷入 すると、 クライべロマイセス * ラクテイ ス、 スポロポロマイセス * ォ ドラスなどの酵母由来の塩基性ァ ミ ノ酸残基対特異的プロテア一 ゼが、 P r o— A r g配列の C末端側も効率的に加水分解する。 こ のことを利用して、 P r o— A r gの C末端側を前記プロテアーゼ により特異的に加水分解した後、 プロリ ンカルポキシぺプチダーゼ (R. C. 3.4.16.2)を作用させることにより、 目的とするペプチ ド又 は蛋白質を得ることができる。
    [0066] タンデム型融台蛋白質は、 下記式 [Π] 又は [ΙΠ] で表される単 位を少なく とも含み、 かつ宿主微生物により生産可能であればよい, なお、 微生物により生産可能である限り、 タンデム型融合蛋白質に は、 キャ リア一 Aが存在しなく てもよい。
    [0067] - B - C^-n [ Π]
    [0068] -ec - B^- n [Π]
    [0069] [式中、 Bは酵素的に切断可能な X! - X2 (X I は、 L y s、 A r g又は P r oを示し、 X2 は、 L y s又は A r gを示す。 但し、 X！ が P r oであるとき、 X 2 は A r gである） で表されるジぺプ チ ドを示す。 Cは目的とするペプチ ド又は蛋白質、 n は 2以上の整 数を示す]
    [0070] なお、 前記式 [ Π〕 [ΠΙ] 中、 N末端又は C末端に、 キャ リ ア— A、 ジぺプチ ド B又は目的べプチ ド Cが結合していない場合には、 N末端にはア ミ ノ酸の H、 C末端にはア ミ ノ酸の 0 Hが結合してい る。
    [0071] 前記単位 [ Π ] を含むタンデム型融合蛋白質の構造と しては、 例 えば、
    [0072] A- B一 C ) n [ Π a ]
    [0073] C- B一 Cチ ■B - A [ Π b ]
    [0074] n
    [0075] C- B一 Cチ n ■A [ Π c ]
    [0076] C- 一 C ) n [ Π d]
    [0077] などが挙げられる。 また、 前記単位 [m] を含むタンデム型融合蛋 白質の構造としては、 例えば、
    [0078] Α一 B- C - Bチ n C [m b ]
    [0079] A- C— B n C [m c ]
    [0080] ( C - n C [in d ]
    [0081] などが挙げられる。
    [0082] 前記夕 ンデム型融合蛋白質の構造の中で、 キャ リ アー Aとジぺプ チ ド Bとが結台した構造 [D a ] [ Π b ] [M a ] [ffl b ] や、 キ ャ リア一 Aと、 タ ンデム化した目的ペプチ ド C及びジペプチ ド Bと が結台した構造 [ li e ] [ΠΙ c ] 、 特に構造 [ Π a ] [Π b ] [Π c ] が好ま しい。
    [0083] 夕ンデム型融合蛋白質から目的べプチ ド又は蛋白質を得るには、 融合蛋白質の結台様式に応じて、 Bを特異的に.認識し、 ジペプチ ド を特異的に加水分解するプロテアーゼと、 必要に応じて、 ペプチ ド 鎖の C末端側又は N末端側から塩基性ァ ミ ノ酸を特異的に遊離する エ ン ドべプチダ一ゼとを同時にまたは順次作用させればよい。 より 具体的には、 タ ンデム型融台蛋白質に、 Bを特異的に認識し、 ジぺ プチ ドの C末端側で特異的にぺプチ ド結合を加水分解するプロテア ーゼと、 ぺプチ ド鎖の C末端側から塩基性ァ ミ ノ酸を特異的に遊離 するカルボキシぺプチダーゼとを同時にまたは順次作用させること により、 目的とするペプチ ド又は蛋白質を得ることができる。 また、 同様に Bを特異的に認識し、 ジぺプチ ドの N末端側を'特異的に加水 分解するプロテア一ゼと、 ぺプチ ド鎖の N末端側から塩基性ァ ミ ノ 酸を特異的に遊離するァ ミ ノぺプチダーゼを同時又は順次作用させ ることにより、 目的とするペプチ ド又は蛋白質を得ることができる。 さ らに、 Bを特異的に認識し、 ジペプチ ド間を特異的に加水分解す るプロテア一ゼと、 ぺプチ ド鎖の N末端側及び C末端側から塩基性 ァ ミ ノ酸を特異的に遊離するァ ミ ノぺプチダーゼ及び力ルポキシぺ プチダーゼを同時又は順次作用させることによつても、 目的とする ぺプチ ド又は蛋白質を得ることができる。
    [0084] 特に好ま しい方法は、 目的ペプチ ド間に、 L y s — A r g又は A r g - A r g配列を挿入したタ ンデム型融合蛋白質を生産した後、 L y s一 A r g又は A r g— A r gを特異的に認識し、 ジぺプチ ド の C末端側で加水分解を触媒するプロテアーゼと、 塩基性ァミ ノ酸 に特異的なカルボキシぺプチダ τゼとを作用させて目的ペプチ ドを 得る方法である。 この方法は、 目的ペプチ ド間に揷入する配列が 2 ア ミ ノ酸と極めて短いこと、 揷入するジペプチ ド X i - X 2 がぺプ チ ド中に殆ど存在しないため汎用性が極めて高いこと、 2種類又は ' 3種類の酵素を同時に作用させることが可能であるため、 操作が容 易であり、 ステツプ数が少ないなどの多く の利点を有する。
    [0085] 目的とするぺプチ ド又は蛋白質の N末端側や C末端側に L y s や A r gが存在する場合には、 その構造を十分に活かした融合蛋白質 の構造を設計し、 目的とするぺプチ ド又は蛋白質の構造に応じた切 断方法が選択される。 より詳細には、 いくつかの C末端ア ミ ド化ぺ プチ ドにおいて、 その生合成前駆体である C末端 G 1 y - L y s - A r g延長ペプチ ドが、 成熟型のぺプチ ドより も活性が強い例が報 告されている （特開昭 6 2— 24 6 5 9 5号公報） 。 このよ うなぺ プチ ドを生産する場台には、 ペプチ ド間に G l y — L y s — A r g をスぺーサ一と して揷入したタンデム型融蛋白質を生産し、 L y s 一 A r gを特異的に認識し、 その C末端側を特異的に加水分解する プロテア一ゼを作用させることにより、 目的とする G l y— L y s 一 A r g延長ペプチ ドを得ることができる。 また、 L y s — A r g を特異的に認識し、 その間を特異的に加水分解するプロテアーゼと、 N末端側から塩基性ァ ミ ノ酸を特異的に遊離するア ミ ノぺプチダー ゼとを同時に又は順次作用させることにより、 G l y _ L y s延長 ペプチ ドを得ることができる。 同様な' G 1 y — L y s延長ペプチ ド は、 L y s — A r gを特異的に認識し、 その C末端側において特異 的に加水分解するプロテアーゼと、 C末端側から A r gのみを特異 的に遊離する力ルポキシぺプチダ一ゼとを同時に又は順次作用させ る ことによつても得る こ とができる。
    [0086] 本発明の製造方法の利点を、 前記 V I P - G 1 yを例にとって、 より具体的に説明する。 V I P— G 1 yの内部には、 前記のように、 M e t、 A r g、 A r g— L y s、 L y s — L y s、 A s pなどの プロセシングシグナルとなり う る配列が含まれているため、 従来報 告されている方法により、 融合蛋白質から V I P— G l yを切りだ すのは困難である。 しかしながら、 酵母由来の'塩基性ア ミ ノ酸残基 対特異的プロテアーゼは、 X— A r g (Xは、 L y s、 A r g文は P r oを示す） 配列を特異的に認識し、 ジぺプチ ドの C末端を優先 的に加水分解する特性を有している。 このことを利用して、 V I P - G l yの生産が可能となる。 すなわち、 例えば、 キャ リ ア一と し て、 プロテイ ン Aの 1位から 4 0 2位と、 スぺ一サーである Arg- G! y-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-Val-I 1 e-G 1 u-G 1 y-Arg-Met-Thr-11 e-Phe-T hr- Phe- Argと力《結合したキヤ リァーを用い、 目的ぺプチ ドとして、 5分子の V I P - G 1 yを L y s — A r gを介して結台したぺプチ ドを用い、 前記キャ リア一とべプチ ドとが結合した夕ンデム型融合 蛋白質 （以下、 P A V I P G ( P ) R 5と略称する） を枯草菌を宿 主として菌体外に分泌生産する。 前記 P A V I P G ( P ) R 5には、 血液凝固因子 X aの認識配列である I 1 'J 一 G 1 u — G 1 y - A r g、 カ リ ク レイ ンの認識配列である P h e — A r g、 酵母クライべ ロマイセス * ラクティ ス由来の塩基性ァ ミ ノ酸残基対特異的プロテ ァーゼの認識配列である L y s — A r gが含まれている。 P A V I P G ( P ) R 5を精製した後、 酵母クライべロマイ セス · ラクティ . ス由来の塩基性ァミ ノ酸残基対特異的プロテアーゼ （特開平 2 - 4 9 585号公報 ； 以下、 P B R S -Protease と略称する） により単 独で限定分解することにより、 L y s — A r gの C末端側の分解が 生じ、 V I P— G l y — L y s — A r g及び V I P - G 1 yが生成 する。 また、 P A V I P G ( P ) R 5に、 P B R S — Proteaseと力' ルポキシぺプチダーゼとを同時に又は順次作用させることにより、 V I P— G l yのみを得ることができる。
    [0087] 前記融合蛋白質を生産する宿主微生物は、 例えば酵母、 カビなど であってもよい力《ヽ ェシ リ ヒア （Escherichia) 属、 バチルス （Ba cillus) 属、 又はスタフイ ロコッカ ス (Staphylococcus) 属微生物 であるのが好ま しい。 バチルス属の微生物、 特にバチルス ' ズブチ リ ス (Bacillus subtj_lis) は、 安全性が高く、 菌体外に蛋白質を 多量に分泌する。 さ らに、 バチルス ♦ ズプチリ スの中で、 菌体外へ のプロテアーゼ生産性を突然変異などの手法により低下させた菌株 が好ましい。 このような菌株をプラスミ ドにより形質転換する場台 には、 宿主に由来するプロテア一ゼによる融合蛋白質の分解を著し く抑制でき、 V I P - G 1 yを効率よく多量に得ることができる。 プロテア一ゼ生産性の低い枯草菌としては、 例えば、 （1) バチル ス * サブチ リ ス （Bacillus subti 1 is) D B 1 04株 [ J . Bacteri ol .. 160; 442-444, (1984) ] 及びバチルス · サブチ リ ス 1 04 H L株 [Biochem. Biophys. Res. Commun.. 128; 601-606, (1985)] (2) 本出願人が特開昭 64 - 3 7 284号公報において提案したバ チルス · サブチ リ ス D Y— 1 6株 （工業技術院微生物工業技術研究 所に受託番号 ： 微ェ研菌寄第 9488号 （ F E RM P— 9488》 と して寄託されている） ； （3〉 アルカ リプロテアーゼ及び中性プロ テアーゼの生産能を欠き、 かつプロテアーゼ活性が野生株の 3 %以 下である枯草菌に、 s ΡΟΟΑΔ 677 変異遣伝子を導入じた菌株などが '挙げられる。 特に好ま しい菌株は上記（3) に属する菌株であり、 こ のような菌株には、 例えば、 特願平 1 — 28 1 44 0号において、 本発明者らが提案したように、 バチルス · サブチリ ス 1 04 H L株 に spo ΟΑΔ 677 変異遺伝子を導入したバチルス · サブチリ ス S P 0 1 1株 （工業技術院微生物工業技術研究所に 1 989年 9月 1 日付 で受託番号 ： 微ェ研菌寄第 1 0 98 7号 （ F E R M P - 1 0 98
    [0088] 7 ) と して寄託されている） 、 バチルス · サブチリ ス D Y— ] 6株 に s p ΟΟΑΔ 677 変異遺伝子を導入したバチルス · サブチリ ス S P L 1 4株 （工業技術院微生物工業技術研究所に 1 98 9年 9月 1 日付 で受託番号 ： 微ェ研菌寄第 1 0 988号 （ F E RM P - 1 0 98
    [0089] 8 ) と して寄託されている） などが含まれる。
    [0090] 融合蛋白質にプロテアーゼを作用させる条件は、 使用するプロテ ァーゼに適台した緩衝液、 添加物の共存下、 並びに P H条件下で行 なう ことができる。 前記添加物と しては、 例えば、 尿素、 塩酸グァ 二ジ ン、 塩化カルシウム ； ラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ウム （以下、 S D S と略称する） 、 ト リ ト ン（Triton) X— 1 ◦ 0、 ルブロール（Lubrol) P Xなどのィォン性、 非ィォン性又は両性界面活性剤 ； メ タノール、 エタ ノ ール、 イ ソプロパノ ール、 ァセ トニ ト リ ルなどの有機溶媒 ； ジイ ソプロ ピルフルオロフ ォ スフ ユ イ ト （D F P ) 、 フ エ二ルメ 夕 ンスルホ ン酸フルオ リ ド （ P M S F ) 、 パラ ク ロ ロ水銀安息香酸 ( P C M B ) 、 ョー ドアセ ト ア ミ ド （ I A A) 、 エチ レ ンジァ ミ ン テ ト ラアセテー ト （ E D T A) 、 o — フ エナ ン ト 口 リ ン、 ロイぺプ チン、 ぺプスタチン Aなどの阻害剂などが挙げられる。 より具体的 には、 酵母クライべロマイセス · ラクティ ス由来の塩基性ア ミ ノ酸 残基対特異的プロテアーゼ P B R S -Protease を用いる場合には、 p H 6〜 1 0、 好ま しく は 6〜 8程度、 温度 1 5〜 6 ◦ °C、 好ま し く は 2 5〜 5 0 程度の反応条件で行なう ことができる。 また、 添 加物の濃度は、 適宜選択でき、 伊 }えば、 塩化カルシウムの好ま しい 濃度は 0. 0 1〜 ： L 0 m M程度、 尿素の好ま しい濃度'は 0. 1〜 6 M程度、 S D Sの好ま しい濃度は 0. 0 0 1〜◦ . 1 %程度、 ルブ ロール P Xの好ま しい濃度は 0. 0 1〜 1 0 %程度である。 p Hは、 適当な酸や塩基の添加により調整してもよく、 適当な緩衝液、 例え ば、 ト リス—塩酸、 リ ン酸、 コハク酸、 酢酸、 3 , 3—ジメチルダ ル夕ル酸、 フマル酸などを含む緩衝液により調整してもよい。
    [0091] 酵素は、 高純度のものを使用するのが好ま しいが、 基質融台蛋白 質の目的とする部位以外で加水分解が生じない程度であれば、 純度 は問わない。 また、 純度の低い酵素と阻害剤とを共存させて反応さ せてもよい。 この場合、 阻害剤として、 利用するプロテア一ゼを阻 害せず、 かつ目的とする都位以外で加水分解する夾雑プロテアーゼ の作用を阻害する阻害剤を用いると、 目的とする部位以外でのプロ テアーゼによる分解を抑制することも可能である。
    [0092] 酵素量は、 基質融合蛋白質 1 モルを限定分解するためには、 プ 口テアーゼ 0. 0 0 1〜 1 0 0 U、 好ま しく は◦ . 0 1〜 ： L 0 U程 ， 度である。 なお、 1 Uは、 低分子の台成基質、 例えば B o c - G 1 n - A r g - A r g - M C A ( B o c は 一ブトキシカルボニル基、 M C Aは 4—メチルクマリル一 7—アミ ドを示す） を用いて目的と する部位 （A r g - A r gと M C Aの間） において： l分間に 1 モ ルの基質の加水分解を触媒する酵素量である。 アミ ノぺプチダーゼ、 カルボキシぺプチダーゼを共存又は独立して反応させる場合、 ァ ミ ノぺプチダーゼ、 カルボキシぺプチダーゼの使用量は、 エン ド型プ 口テア一ゼに対して、 0. 0 1〜 1 ◦ 0 0 0倍程度、 好ま しく は 1 C！ 〜 1 0 0 0倍程度の活性を有する量である。 基質融合蛋白質と酵素との反応.は、 遊離の酵素、 または担休に酵 素を固定化した固定化酵素を用いてバッチ式で行なってもよい。 固 定化酵素の担体と しては、 慣用の担体、 例えば、 ポリアク リルア ミ ド、 キチン、 デキス トラ ン、 Λ —カラギ一ナン、 セライ ト、 セル口 ースなどが挙げられる。 また、 反応は、 遊離の酵素と膜型のバイオ リアクターとを組合せて行なってもよく、 固定化酵素'を用いて連続 式バイオリァク夕一などを用いて行なってもよい。
    [0093] 前記融合蛋白質を生産する宿主微生物は、 慣用の遣伝子操作技術 により調製できる。 例えば、 キャ リ アー Aが連結された融合蛋白質 を生産する宿主微生物を例にとって説明すると、 次の通りである。 先ず、 前記融合蛋白質の構造に対応させて、 キャ リ アー Aをコ— ドする遣伝子と、 ペプチ ド又は蛋白質 Cをコー ドする遺伝子とを、 前記ジペプチ ド Bをコー ドする遺伝子を介して連結する。 得られた 遣伝子断片に、 発現のための制御部位であるプロモーター、 リポソ —ム結台部位、 及び必要に応じて分泌シグナルを連結し、 得られた D N A断片を、 ベク タ一 D N Aに連結することにより、 プラス ミ ド を構築できる。 D N Aの連結には、 通常の連結技術、 例えば制限酵 素を用いて切断した D N Aとべクター D N Aとをリガーゼを用いて 連結する制限酵素法、 リ ンカ一法などにより構築できる。
    [0094] なお、 ベクター D N Aは、 宿主微生物により複製可能な D N Aで あればよいが、 前記のバチルス属 iffl菌で複製可能なプラス ミ ドの D N Aであるのが好ま しい。 このようなベクタ一と しては、 例えば、 ス夕フイ ロコ ッカス厲由来のプラス ミ ド p U B 1 1 0、 p C 1 94 p B D 64 p E 1 94 s p S A O 5 0 1、 p T 1 2 7およびこれ らの誘導体が挙げられる。 好ま しいベクタ一 D Ν Αは、 プラスミ ド p U B 1 1 0の D N Aでぁる。 これらのプラス.ミ ドを有するバチル ス · ズプチリ スは、 いずれもオハイオ大学バチルスス ト ッ クセンタ 一 （住所 ： 484, Vest 12th Avenue. Columus Ohaio, 43210 U.S.A.) から入手できる。 また、 タ ンデム型融合蛋白質を生産させる場合、 複数のペプチ ド をコ— ドする遺伝子の構築、 各遺伝子断片の連結には、 慣用の遣伝 子操作法が利用できる。 その際、 大腸菌の宿主ベクターなどを利用 することもできる。 例えば、 夕ンデム型遺伝子の構築を V I P— G l yを例にとって説明すると、 次の通りである。 複数の V I P - G 1 yをコー ドする遺伝子.の構築には、 V I P— G 1 y遺伝子の 5 ' 側に、 制限酵素 T t h 1 1 1 I の切断認識塩基配列である G A C N N N G T Cが存在することを利用できる。 前記制限酵素 T t h 1 1 1 I による切断片は、 突出末端であるが対称構造を有していないの で、 制限酵素 T t h 1 1 1 I による切断部位を利用して、 ぺプチ ド をコー ドする複数の遺伝子を目的の方向に導入する切断点として極 めて有用である。 すなわち、 揷入する V I P - G 1 y遺伝子として、 5 ' 側に制限酵素 T t h 1 1 1 I の切断部位を有し、 3 ' 側に前記 制限酵素の切断部位を有しない遺伝子を合成する。 一方、 V I P - G 1 y遺伝子が導入されたブラス ミ ドを制限酵素 T t h 1 1 1 I で 切断すると共に、 5 ' 側のリ ン酸残基をアル力.リホスファターゼに より除去し、 前記揷入する V I P - G 1 y遺伝子を D N Aリガーゼ により連結する。 得られたベクターにより大腸菌を形質転換すると 共に、 形質転換株を培養し、 2つの V I P— G l y遺伝子が導入さ れたプラス ミ ドを調製する。 上記操作を繰返し行なう ことにより、 この T t h 1 1 1 I 切断部位を利用して、 理論的には、 何回でも、 V I P— G 1 y遺伝子の夕 ンデム化が可能であり、 複数の V I P— G 1 y遺伝子が連結されたブラ.ス ミ ドを調製できる。
    [0095] なお、 制限酵素 T t h 1 1 1 Iが認識する切断部位を、 V I P - G 1 y以外の他のペプチ ドをコー ドする遺伝子の 5 ' 側に付加し、 前記と同様にして順次連結することにより、 他のペプチ ドをコー ド する遺伝子をタ ンデム化できる。 - 前記べプチ ドをコ一 ドする遺伝子の数は、 2以上であればよい力 通常、 2〜 2 0程度である。 複数のペプチ ドをコー ドする遺伝子は、 生物から抽出してもよく 化学合成してもよい。 複数個のペプチ ドをコー ドする遺伝子と して 化学合成した遺伝子を複数用いるのが好ま しい。 また、 複数のぺプ チ ドは、 同種の複数のペプチ ドで構成されていてもよく 、 異種の複 数のペプチ ドで構成されていてもよい。
    [0096] 前記のようにして得られたプラス ミ ドにより、 宿主'微生物を形質 転換する ことにより、 融合蛋白質を生産する微生物が得られる。 前 記プラス ミ ドによる宿主微生物の形質転換は、 慣用の方法、 例えば. チャ ン（Chang) らのプロ トプラス ト化法 [ Chang , S . . et a l .， Mo l · Gen . Gene t . . 168 , 1 1 1- 1 1 5 ( 1 979 ) ] などを利用して行なう こと ができる。
    [0097] 前記融合蛋白質は、 前記形質転換された宿主微生物を培養するこ とにより得られる。 なお、 融合蛋白質が菌体内やペリ プラズムに蓄 積される場合には、 慣用の方法、 例えば、 菌体を破砕するこ とによ り、 融合蛋白質を得ることができる。 宿主微生物の培養は、 慣用の 液体培養に準じて行なう こ とができる。 すなわち、 形質転換株の培 養は、 慣用の成分、 例えば、 無機塩、 炭素源、 窒素源、 増殖因子成 分などを含む液体培地で、 振盪培養又は通気撹拌培養法により行な う ご；とができる。 培地の p Hは、 例えば、 7〜 8程度である。 培養 は、 微生物の培養に採用される通常の条件、 例えば、 温度 1 5〜4 5 °C、 好ま しく は 2 5〜 4 0 、 培養時間 6〜' 6 0時間程度の条件. で行なう こ とができる。 ' 産業上の利用可能性
    [0098] 本発明の製造方法は、 医薬などと して有用なペプチ ド及び蛋白質 を得る上で有用である。 以下に、 実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、 本発 明はこれらの実施例に限定されるものではない。 なお、 実施例で用 いた酵素は、 いずれも寳酒造㈱製の酵素であり、 それらの仕様に記 載されている条件で反応を行った。
    [0099] , 実施例
    [0100] 実施例 1
    [0101] 融合蛋白質 P A V I P G (P ) R 5から V I P— G' l y— L y s — A r_g¾び V I P - G 1 yの切りだし
    [0102] (1) 塩基性ァミ ノ酸残基対特異的プロテアーゼの調製
    [0103] クライべロマイセス * ラ クテイス （ I F O 1 9 0 3 ) を YM培 地 30£ 中で 2日間培養し、 培養液を遠心分離して湿重量 3 1 4 g の菌体を回収した。 この菌体を 3 0 0 mlの緩衝液 1 [ 1 0 mMの ト リ ス—塩酸緩衝液 （ P H 7. 0 ) 、 0. 5 mMの塩化カルシウム] に懸濁し、 ダイノーミ ルで菌体を破砕し、 破砕液を、 1 7 0 0 g、 ' 1 0分間の遠心分離に供し菌体残渣を除去し、 得られた上清を、 1 5 0 0 0 0 g . 6 0分の超遠心分離に供し、 沈澱と して膜画分 7 9. 4 gを調整した。 この膜画分を 6 0 Omlの抽出用緩衝液 [ 1 0 mM の ト リ ス一塩酸緩衝液 （ p H 7. 0 ) 、 3 %のルブロール P X、 0. 1 Mの塩化ナ ト リ ウム〕 に懸濁し、 一晚撹拌して酵素を抽出し、 超 遠心分離に供し、 上清として膜抽出液を得た。
    [0104] この抽出液を 5 0てで 3 0分間熱処理し、 生成した沈澱を、 3 9 0 0 0 g . 2 0分間の遠心分離により除去し、 限外濾過により濃縮 した後、 緩衝液 2 [ 1 0 mMの ト リス—塩酸緩衝液 （p H 7. 0 ) - 0. 5 m Mの塩化カルシウム、 0. 2 %のルブロール P X ] に透析 して得られた画分を熱処理膜抽出液とした。
    [0105] この画分を緩衝液 2で予め平衡化した D E A E— トヨパール 6 5 0 M ( 2. 5 X 4 0 cm) に注入し、 同緩衝液で十分に洗浄した後、 0〜0. 6 M塩化ナ ト リ ゥムの勾配溶出法により酵素を溶出し活性 画分を得た。
    [0106] 活性画分を限外濾過により濃縮した後、 0. 5 Mの塩化ナト リ ウ ムを含む緩衝液 2を、 予め平衡化したコ ンカナパ リ ン A (Con A) —セフ ァ ロ一ス （ 1. 6 X 2 5 cm) に注入し、 同緩衝液で十分洗浄 した後、 0. 5 Mの塩化ナ ト リ ウム、 0. 6 7 Mのひ ー メ チルー D —マ ンノ シ ドを含む緩衝液 2で溶出した。 活性画分を濃縮し、 Con A—セファロ一ス画分と した。
    [0107] Con A—セファロ一ス画分を緩衝液 2に透析し、 同'緩衝液で予め 平衡化したアルギニン ーセフ ァ ロ一ス （ 1. 6 x 5 0 cm) に注入し、 十分に平衡化した後、 0〜 0. 5 M塩化ナ ト リ ウム勾配溶出法によ り溶出し、 活性画分を限外濾過により濃縮し、 アルギニン 一セフ ァ 口一ス画分と した。
    [0108] アルギニンーセフ ァ ロ一ス画分を緩衝液 2に透析し、 同緩衝液で 予め平衡化したモノ Q (M o n o Q、 0. 5 x 5. 0 cm) に注入 し、 同緩衝液で十分に洗浄した後、 0〜 0. 5 M塩化ナ ト リ ウム勾 配溶出法により溶出したところ、 活性画分と して 2つのピーク得ら れた。 これらの画分を別個に回収して濃縮し、 それぞれ M o n o Q -" M o n o Q - Π画分と した。 これらの画分を別個に緩衝 液 2に透析し、 予め同緩衝液で平衡化したベンズア ミ ジ ン一セフ ァ ロース （ 1. 6 X 5, 0 cm) に注入し、 同緩衝液で十分に洗浄した 後、 0 ~〔〕 . 5 M 塩化ナ ト リ ウム勾配溶出法により酵素を溶出し た。 得られた活性画分をそれぞれ B e n z - I 、 B e n z — Π画分 と した。
    [0109] 塩基性ァ ミ ノ酸残基対特異的プロテアーゼの精製工程の要約を表 に示す。 表 1
    [0110]
    [0111] 1Uは、 30。C、 50mMトリス塩酸 （pH7. 0)、 1 %ルブ口一ル P X、 0. 5mMC a C£ 2 屮において 0. 1 mMの Boc— G i n — A r g— A r g— MCAと反応させる条忭において、 1分間に；! ^ mo 1の AMCを遊離する活性とした。
    [0112] (B o cは t—ブトキシカルボニル基を、 MC Aは 4—メチルクマリル— 7—アミ ドを、 AM Cは 7—アミノ—4ーメチルークマ >ンを表す。
    [0113] (2) プラスミ ド p M D 2 (3 ◦の f冓築
    [0114] バチルス · ズブチリ スを宿主と し、 スタフィ ロコ ッ カス ♦ ァウ レ ウスのプロテイ ン A遺伝子を発現し、 培養上清中にプロテイ ン Aを 分泌生産するブラス ミ ド p MD 2 0 ◦の構築図を第 1図に示す。
    [0115] プロテイ ン A遣伝子を含むプラス ミ ド p D C P 24 1 1 (特開昭 6 3— 24 5 6 7 7号公報参照） は、 スタフイ ロコ ッカス · ァウ レ ウスの 1菌株からク ローニングしたプロティ ン A遣伝子を、 大腸菌 で複製可能なプラス ミ ド p U C l 1 8に連結したプラス ミ ドである。 p D C P 24 1 1 の取得法、 および P D C P 24 1 1 に含まれるプ 口ティ ン A遺伝子の全塩基配列は、 前記特開昭 6 3 - 24 5 6 7 7 号公報に詳細に記載されている。 このプラス ミ ドを含む大腸菌形質 転換株力ヽらヽ ァノレカ リ法 [Sambrook.. et al .. Moleculer Cloning . , 1 , 33 (1989) ] により p D C P 24 1 1 を調製した。
    [0116] p D C P 24 1 1を制限酵素 E c o R I と B a m H I とで切断し、 生成したプロテイ ン A遺伝子を含む約 1. 9 k bの D N A断片 （以 下、 プロテイ ン A遺伝子断片という） をァガロースゲル電気泳動法 を用いて分離した後、 電気溶出法を用いて溶出し、 精製した [Samb rook, et al .. Molecular Cloning, 6 , 28 (1989) ] 。 前記ブロテ イ ン A遺伝子断片は、 プロテイ ン A遺伝子のプロモータ一、 リボソ —ム結台部位、 分泌のためのシグナル配列、 およびプロテイ ン Aの 構造遺伝子を含んでいる。 '
    [0117] 次いで、 ベクタ一となる p U B .l 1 0を制限酵素 E c o R I と B a m H I とで切断し、 生じた約 3. 7 K b k bの D N A断片 （以下、 p U B 1 1 0ベクター遣伝子断片という） を、 上記と同様にして、 ァガロースゲル電気泳動法を用いて分離した後、 電気溶出法を用い て溶出し、 精製した。
    [0118] プロテイ ン A遣伝子断片と、 p U B 1 1 ϋベク タ一遺伝子断片と を、 Τ 4 D N Aリガーゼを用いて連結し、 プラス ミ ド p MD 2 0 0 を構築した。 (3) V I Pをコ一 ドする遣伝子を含むブラス ミ ドの構築
    [0119] V. I P遣伝子を構築するため、 V I Pのア ミ ノ酸配列に従って、 対応する遣伝子コ ドンを枯草菌のコ ドン使用頻度に合せ、 下記の 8 種類の遺伝子を、 A B I 4 3 0 A D N A合成装置で作製した。
    [0120] 5 ' -TCTAGAGTCGACGTCATTGAAGGAAGAATG
    [0121] ACAATTTTTACATTCAGGCATAGCGACG-3 '
    [0122] 3 '-CTCAGCTGCAGTAACTTCCTTCTTAC
    [0123] TGTTAAAAATGTAAGTCCGTATCGCTGCG-5' 5 ' -CAGTCTTCACAGATAACTACACGCGTTTAA
    [0124] GAAAGCAAATGGCTGTG-3'
    [0125] 3 ' -TCAGAAGTCTCTATTGATGTGCGCAAATT
    [0126] CTTTCGTTTAGC-5' 5 ' -AAAAAATATTTGAATTCTATTCTTA
    [0127] ACGGCTAATAGATCTAAAAAGAAGCAGGr3 '
    [0128] 3 ' -GACACTTTTTTATAAACTTAAGATAAGAAT
    [0129] TGCCGATTATCTAGATTTTTCTT-5 ' 5 ' -TTCCTCCATACCTGCTTCTTTTTAT
    [0130] TTGTCAGCATCCTGATGTTGGATCCGCATG-3'
    [0131] 8 ' -CGTCCAAGGAGGTATGGACGAAGAAAAATA
    [0132] AACAGTCGTAGGACTACAACCTAGGC-5 '
    [0133] T4 一 D N Aキナーゼを用いて、 それぞれの合成 D N Aの 5 ' 末 端にリ ン酸を付加した。 また、 プラス ミ ド p U C 1 9を制限酵素 X b a l と S p h l とで切断し、 D N Aリガ一ゼにより、 5' 末端に リ ン酸を付加したそれぞれの合成 D N Aを、 p U C 1 9の X b a I — S p h l 間に挿入し、 V I P ^ G l y遺伝子を含むプラス ミ ド p MD 3 2 1 aを構築した。 第 2図にプラス ミ ド p MD 3 2 1 aの構 築図を示す。
    [0134] 得られた p MD 32 1 aにおける合成遺伝子部分の塩基配列およ びァ ミ ノ酸配列を以下に示す。
    [0135] EcoRI Sad Kpnl SmalBamHI Xbal
    [0136] AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGA
    [0137] PheGl uLeuGl yThrArgGl ySerSerArg '
    [0138] Hid IAatl I 60
    [0139] GTCGACGTCATTGAAGGAAGAATGACAA
    [0140] ValAspVal I leGluGlyArgMetThrl le
    [0141] Xa
    [0142] Tthllll
    [0143] TTTTTACATTCAGGCATAGCGACGCAGTCTTC
    [0144] PheThrPheArgHisSerAspAlaValPhe
    [0145] プロテイ ン C. V IP
    [0146] 120
    [0147] ACAGATAACTACACGCGTTTAAGAAAGC
    [0148] ThrAspAsnTyrThrArgLeuArgLysGl n
    [0149] EcoRI
    [0150] AAATGGCTGTGAAAAAATATTTGAATTCTATT
    [0151] MetAl aVal LysLysTyrLeuAsnSer 11 e
    [0152] Bgl 11 180
    [0153] CTTAACGGCTAATAGATCTAAAAAGAAG
    [0154] し euAsnGly 木木
    [0155] CAGGTTCCTCCATACCTGCTTCTTTTTATTTG BamHI Sphl
    [0156] 240
    [0157] TCAGCATCCTGATGTTGGATCCGCATGC
    [0158] Hindi 11 [ ""- » pUC19シ一ケ ンス
    [0159] AAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTC
    [0160] 300
    [0161] GTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCA
    [0162] この合成遣伝子部分は、 V I P - G l yをコ一 ドする塩基配列と、 その前に存在する、 血液凝固因子 X aの認識配列 I 1 e G 1 u G 1 y A r g、 B r C Nにより切断される M e t 、 およびプロテイ ン C の認識配列 T h r I 1 e P h e T h r P h e A r gをコー ドする遣' 伝子より構築されている。
    [0163] また、 V I P— G 1 y遺伝子の下流には、 2つの終始コ ドン （T A A T A G ) の後に、 枯草菌のズブチリ シ ンの夕一ミ ネ一夕一 [M. Honjo. et aし， J. Biotechnology, 2, 75-85 (1985)] 力存在する。
    [0164] (4) 5分子の V I Pをコー ドする遺伝子を含むプラ スミ ドの構築 5分子の V I Pをコー ドする遣伝子 （以下、 タンデム型 V I P遣 伝子という） を含むプラ スミ ド p MD 3 2 1 R 5 aの構築図を第 3 図に示す。
    [0165] p MD 3 2 1 aの V I P— G l y遣伝子の 5 ' 側には、 制限酵素 T t h 1 1 1 I の切断認識塩基配列である G A C G C A G T Cが存 在する。 一方、 第 3図に示されるように、 揷入する V I P遺伝子の 5 ' 側に T t h 1 1 1 I切断部位を残し、 3 ' 側が切断不能な遣伝 子を合成した。
    [0166] また、 タンデム化した V I P - G 1 yを切断して回収するため、 塩基性残基対特異的プロテアーゼ （特開平 2 - 4 9 585号公報） による切断の認識配列である L y s— A r gに対応する遺伝子を導 入するこ とにより、 第 3図に示すよう に、 タ ンデム化のための V I P - G 1 y - L y s - A r g遺伝子を合成した。
    [0167] 次いで、 p MD 3 2 1 aを T t h i 1 1 I で完全に切断し、 アル カ リホスフ ァ タ一ゼにより、 この 5 ' 側のリ ン酸基を除去した。 そ して、 作製したタ ンデム化のための V I P— G l y - L y s - A r g遣伝子と混台し、 D N A リ ガーゼにより連結した後'、 大腸菌 J M 1 0 9株を形質転換した。
    [0168] 得られたアンピシリ ン耐性の形質転換株からブラス ミ ド遺伝子を 調製し、 目的通り V I P— G 1 y遺伝子が 2個タ ンデムに連結され たプラス ミ ド p MD 3 2 1 R 2 aを構築した。
    [0169] 得られた p M D 3 2 1 R 2 aは、 2個のタ ンデムに槃つた V I P 一 G 1 y遺伝子の 5 ' 領域付近に T t h 1 1 ] I による切断点を唯 —有している。
    [0170] そ して、 p MD 3 2 1 R 2 aを T t h l 1 1 I で切断し、 アル力 リ ホスフ ァ タ一ゼにより 5 ' 領域を脱リ ン酸化した後、 タ ンデム化 のための V I P — G l y — L y s — A r g遺伝子と混合し、 D N A リ ガーゼにより連結した後、 大腸菌 J M 1 0 9株を形質転換した。 得られたアンピシリ ン耐性形質転換株からプラス ミ ドを調製し、 目 的の遺伝子が 3個夕 ンデムに導入されたプラ ス ミ ド p M D 3 2 1 R 3 aを得た。 同様の操作をさ らに繰返し、 5個の V I P - G 1 y遺 伝子が、 L y s — A r gを介して、 タ ンデムに連結された p MD 3 2 1 R 5 aを作製した。
    [0171] (5) プラス ミ ド p M D 5 0 0 R 5の構築
    [0172] バチルス · ズプチリ スを宿主と し、 5分子の V I Pを含むぺプチ ド前駆体 （以下、 ぺプチ ド前駆体という） を分泌するブラス ミ ド p MD 5 0 0 R 5の構築を第 4図に示す。
    [0173] 前記プラス ミ ド p M D 2 0 0を制限酵素 P s t I で切断した後、 D N Aブラ ンチングキッ ト （Blunting Kit)を用いて末端を平滑化し、 さ らに制限酵素 S p h i で切断し、 約 5. 5 K bの断片をァガロー スゲル電気泳動法により精製し、 タンデム型 V I P遺伝子を組込む ためのベク ター と した。
    [0174] ベクターに組込むタンデム型 V I P遺伝子は、 前記プラスミ ド p M D 3 2 1 R 5 aを制限酵素 K p n Iで切断した後、 D N Aブラ ン チングキッ トを用いて末端を平滑化し、 さらに制限酵素 S p h Iで 切断し、 約 0. 5 K bの断片をポリアク リルアミ ドゲル電気泳動法 により精製するこ とによ り取得した。 この D N A断片は、 血液凝固 因子 X a、 及びプロティ ン Cの認識するァミ ノ酸配列をコ一 ドする 遺伝子の下流に、 タ ンデム型 V I P遣伝子が連結した構造を有して いる。 また、 各 V I P遺伝子の C末端には、 V I Pをアミ ド化する ため、 G 1 yをコー ドする遺伝子を連結している。 さらに、 V I P — G 1 yをコー ドする遺伝子の間には、 ぺプチ ド前駆体夕ンパク質 から V I P— G 1 yを切断して回収するため、 塩基性ァ ミ ノ酸残基 特異的プロ ァ一ゼの一種である P B R S—プロテア一ゼの認識配 列 L y s — A r gをコー ドする遺伝子が揷入されている。
    [0175] 次いで、 ベクター D ΝΆとタ ンデム型 V I P遺伝子断片とを T 4 リガーゼを用いて連結し、 ペプチ ド前駆体タンパク質分泌プラ スミ ド P MD 5 0 0 R 5を構築した。
    [0176] この p M D 5 0 0 R 5は、 バチルス · ズブチ リ スを宿主とし、 キ ャ リア一と、 目的ペプチ ドである 5分子の V I P— G l yが L y s — A r gを介して結合した領域とが結合した構造を有するプラ ス ミ ドである。 キャ リア一は、 プロテイ ン Aの 1位から 4 0 2位と、 ス ぺ―サ一である血液凝固因子 X a及びプロティ ン Cの認識配列に相 当するア ミ ノ酸配列を含む A r g - G 1 y - S e r - S e r - A r g - V a 1 - A s p - V a 1 - 1 l e - G l u - G l y - A r g - M e t — T h e — I l e — P h e — T h r — P h e — A r gとが結 合して構成されている。
    [0177] (6) バチルス * ズプチリ スを宿主とした融台蛋白質 P A V I P G (P ) R 5の生産と精製 チャ ン（Chang) らの方法. [Chan,g, S.. et al . , Mol . Gen. Genet . , 168, 111-115 (1979)] に従って、 p M D 5 0 0 R 5によりバチ ルス · ズプチリ ス S P L 1 4 ( F E R M P - 1 0 9 88 ) を形質 転換した。 得られた形質転換株バチルス ♦ ズブチリ ス S P L 1 4 ( p MD 5 0 0 R 5 ) [工業技術院微生物工業技術研究所に 1 9 0年 9月 2 5日付で受託番号 ： 微ェ研菌寄第 1 1 74'2号 （ F E R M P— 1 1 74 2) と して寄託されている] により分泌される融 台融合蛋白質を以下のようにして精製した。
    [0178] 先ず、 0. 5 Mコハク酸を含む Medium A培地 4 J を用いて、 S P L 1 4 ( p MD 5 0 0 R 5 ) を 3 7 °Cで 1 6時間浸透培養した。 培養停止後、 濃度を 1 0 m Mになるようにプロテアーゼ阻害剤であ るフエ二ルメ チルスルホニルフルオラィ ド （ P M S F ) 、 E D T A を添加し、 4 °C、 5 0 0 0 r p mの条件で、 3 0分間遠心分離し、 菌体を除いた。 得られた培養上清を◦ . 2 2 mのフィ ルターで瀘 過した後、 培養上清 3. 6 1 mlを、 3 0 01111の 1 .20—セファ ロ一 スゲル （フ アルマシア （株） 製） を充填したカラムに約 6 ml 分の 流速で注入し、 融合蛋白質を精製した。 さ らに、 カラムを、 T S T ブア ツファ一 [ 5 0 mMの ト リ ス塩酸 （ p H 7. 6 ) 、 1 5 0 m M の N a Ci？ 、 0. 0 5 %のツイ一 ン（Tween) 2 0 ] 2. 88 を用 い、 流速 4 mlZ分の条件で洗浄した後、 0. 1 M酢酸 （ p H 3. 0) を用いて、 流速 4 mlZ分の条件で鼬台蛋白質を溶出した。 この時、 溶出液は、 1ノ 2倍量の 0. 2 M重炭酸アンモニゥム溶液を用いて 直ちに中和した。 得られた融合蛋白質溶出液を、 限外濾過 （分子量 カッ ト 1 0 0 0 0 ) のフ ィ ルタ一を用いて濃縮した後、 融合蛋白質 を以下の条件で分取した。
    [0179] カラム Pheny卜 5PWRP
    [0180] 内径 2 1. 5 ram X 1 5 cm
    [0181] 流速 6 ml /分
    [0182] 溶媒 A : 0. 0 5 % ト リ フルォロ酢酸 B ： 0. 044 % ト リ フルォロ酢酸 6 0 %ァセ トニ ト リル
    [0183] 傾斜 2 7. 5〜 3 0 %/ 5 0分、
    [0184] 1 2 0 ml / %
    [0185] そして、 分取した成分を凍結乾燥することにより、 目的とする分 子量 64 0 0 0の融合蛋白質を得た。 '
    [0186] 融合蛋白質中の V I P量を、 「酵素免疫測定法」 （石川栄治他編 集、 医学書院） 記載の V I P— G 1 yの酵素免疫測定法により、 次 に示す方法で測定した。
    [0187] 先ず、 V I Pを用いてゥサギを免疫し、 抗 V I P血清を得た。 こ の抗 V I P血清より、 「酵素免疫測定法」 の第 83— 9 2頁記載の マレイ ミ ド— ヒ ンジ法により、 抗 V I P— I g G、 抗 V I P— F ( a b ' ) 2 、 抗 V I P—ペルォキシダーゼ標識一 F a b ' を調製 した。
    [0188] 酵素免疫測定法による V I P - G l yの測定は、 以下の手順で行
    [0189] - つた o .
    [0190] E L I S Aプレー ト （ 96穴） に抗 V I P— F ( a b ' ) 2 を吸 着させ、 1 %牛血清アルブミ ンでブロ ッキングした。 このプレー ト に被試験液を添加した V I P - G 1 yを、 固相に吸着した抗 V I P - F ( a b ' ) 2 に結合させた後、 洗浄し、 更に抗 V I P—ペルォ キシダーゼ標識— F a b 2 を添加し、 固相に結合した V I P— G 1 yをサン ドイ ッチした。 遊離の標識抗体を除去した後、 1 0 mMォ ルトーフエ二レンジァ ミ ン （ 0, P D ) 、 0. 0 2 5 %過酸化水素、 5 0 mM酢酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （ p H 5. 0 ) を含む反応液を添加 し、 ペルォキシダーゼの反応により生成する色素を波長 4 9 0 n m の吸収で測定した。
    [0191] 標準物質として、 アプライ ド ♦ バイオシステムズ （A B I ) 社製 のぺプチ ド合成装置により固相台成し、 逆相高速液体クロマ トグラ フィ 一により精製し、 ァ ミ ノ酸組成を確認した V I P— G l yを用 いた。
    [0192] その結果、 目的とする融合蛋白質が分泌生産されており、 E L I S Aにおいて、 V I P活性を示したピークの波長 2 1 4 nmの吸収か らタンパク質量を算出したところ、 4 J の培養液から、 約 3 7 mgの 融合蛋白質が得られた。
    [0193] 以下に、 融台蛋白質 P A V I P G ( P ) R 5の構造'を模式的に示 す。 なお、 目的とするペプチ ド （V I P— G l y ) を、 2重線のァ ンダーライ ンで示し、 ファ クタ一 X a、 カ リ ク レイ ン、 塩基性ア ミ ノ酸残基対特異的プロテアーゼの認識部位を、 1重線のアンダーラ ィ ンで示す。
    [0194] Protein A(l—402)—ArgGlySerSerArgVa】AspVal—IleGluGly rg—Met Thrl IePheThr-PheArg-VIP-Gl y -LysArg-VI P-G l y-LysArg-VI P-Gl y - LysArg-VI P-Gl y-LysArg-VIP-Gly
    [0195] (7) 融合蛋白質 P A V I P G ( P ) R 5から VI P-Gl y 、 VIP-Gly- Lys-Arg の切りだし
    [0196] 融合蛋白質 1 0 0 〃 g ( l . 5 5 ηモル） を、 前記ステップ（1) で精製した塩基性ァミ ノ酸残基対特異.的プロテア一ゼ （Benz— I画 分） 0. 0 5 m U [ 1 Uは、 3 0 °C、 5 0 mMの 卜 リ ス塩酸 （ p H 7. ◦ ) 、 0. 1 %のルブロール（Lubrol)PX、 0. 5 mMの C a C 2 中において、 0. I mMの B o c — G i n — A r g— A r g— M C A ( B o cは t 一ブトキシカルボニル基、 M C Aは 4ーメチル, クマリル一 7—ア ミ ドを示す） と反応させる条件において、 1分間 に 1 〃モルの AM Cを遊離する活性と した] と、 5 0 mMの 卜 リス 塩酸 （ p H 7. 0 ) 、 I mMの C a Ci 2 中、 3 7。Cで反応させた ( 反応時間 0時間、 6時間における逆相高速ク ロマ トグラフィ ーのク 口マ トグラムを第 5図（A)(B)に示す。 切断反応の進行に伴いピーク 1、 ピーク 2が主に出現した。 このピーク 1 、 ピーク 2を逆相高速 クロマ トグラライ 一により分取し、 ブロティ ンシーケンサ一により そのア ミ ノ酸配列を解析したところ、 ピーク 1 は V I P— G 1 y — L y s — A r g、 ピーク 2は V I P— G l y と完全に一致した。 実施例 2
    [0197] 融合蛋白質 P A V I P G ( P) R 5から V I P— G l yの切り出 し
    [0198] 融合蛋白質 1 0 0 g ( 1. 5 5 nモル） を実施例 1のステップ (1) で精製した塩基性ァミ ノ酸残基対特異的プロテア一ゼ （Benz - I画分） 0. 1 m U ( 1 Uは、 前記と同様な活性を意味する） 、 及 びカルボキシぺプチダーゼ B (シグマ社製） 50 m U [ 1 ϋは、 2_ 5 mMト リ ス塩酸 （ p H 8. ◦ ) 中において、 I mMの B z — G 1 y - A r g ( B zはべンジルォキシカルボ二ル基を示す） と 2 5て で反応させた条件下において、 1分間に 1 //モルの A r gを遊離す る酵素活性とした'] と、 5 ◦ mMの ト リス塩酸 （ p H 7. 0 ) 、 1 mMの C a C£ 2 中、 3 7 °Cで反応させた。 反応時間 0時間、 4時 間における逆相高速クロマ トグラフィ 一のクロマ トグラムを第 6図 (A)(B)に示す。 切断反応の進行に伴い、 前記実施例 1 において V I P - G 1 y と同定された 1つのピークが主に出現し、 V I P - G 1 y — L y s 一 A r gは殆ど出現しなかった。
    [0199] 比較例 1
    [0200] 融合蛋白質 P A V I P G ( P) R 5の血液凝固因子 X aによる限 定分解
    [0201] l O O ^ gの融合蛋白質 P A V I P G ( P ) R 5と血液凝固因子 X a (ベーリ ンガー ♦ マンハイム · 山内社製） 1 5. 5 pモルを、 5 0 mMの ト リス塩酸 （ p H 8. 0 ) 、 I mMの C a C 2 、 0. 1 Mの N a Cj 中で反応させたところ、 目的とする I 1 u— G 1 u — G l y— A r gの C末端側だけではなく V I P内部の A r g 14- L y s間においても切断反応が生じ、 目的とする蛋白質 [M e t — T h r — I 1 e - P h e - T h r - P h e - A r g - (V I P— G 1 y ) 4 - V I P - G 1 y ] は得られなかった。
    [0202] 比較例 2 融合蛋白質 P A V I P G ( P ) R 5の力 リ ク レイ ンによる限定分 l 〇 0 gの融合蛋白質 P A V I P G ( P ) R 5とカ リ ク レイ ン (ヒ ト血清、 シグマ社製） 1 5. 5 pモルを、 5 0 mMの ト リ ス塩 酸 （ p H 8. 0 ) 、 I mMの C a C£ 2 、 0. 1 Mの N a C£ 中で 反応させたところ、 V I P内部の A r g 14— L y s間'、 並びに V I P - G 1 y - ( 1 4 - 2 ) 内において更に切断反応が生じたため、 目的とする蛋白質 [ (V I P— G l y — L y s — A r g ) i - V I
    [0203] P— G 1 y ] は得られなかった。
    权利要求:
    Claims請求の範囲
    1. 下記式 [ I a ] 又は [ I b ]
    A - B - C [ l a ]
    C— B— A [ l b ]
    [式中、 Aは、 キャ リア一を示し、 Bは、 酵素的に切断可能な X I - X 2 ( X I は、 Aの C末端に結合した L y s、 A r g又は P r o を示し、 X2 は、 Cの N末端に結合した L y s又は A r gを示す。 但し、 Χ ι 力《P r oであるとき、 X 2 は A r gである） で表される ジペプチ ドを示す。 Cは、 目的とするペプチ ド又は蛋白質を示す] で表される融台蛋白質を宿主微生物により生産した後、 少なく とも、 前記ジペプチ ドを特異的に認識し、 かつジペプチ ドのペプチ ド結合 を特異的に加水分解するプロテアーゼで処理するべプチ ド又は蛋白 質の製造方法。
    2. 少なく とも、 下記式 [Π] 又は [m]
    - B - ^-η [Π]
    - c - Β^-η [in]
    [式中、 Bは、 酵素的に切断可能な Χ ι — X2 (X ! は、 L y s、 A r g又は P r oを示し、 X2 は、 L y s又は A r gを示す。 但し、 X 1 が P r oであるとき、 X 2 は A r gである） で表されるジぺプ , チ ドを示す。 Cは、 目的とするペプチ ド又は蛋白質、 nは 2以上の 整数を示す]
    で表される単位を含む融合蛋白質を宿主微生物により生産した後、 少なく とも、 前記ジペプチ ドを特異的に認識し、 かつジペプチ ドの ぺプチ ド結合を特異的に加水分解するプロテア一ゼで処理するぺプ チ ド又は蛋白質の製造方法。
    3. 単位 [Π] 又は単位 [m] を含むタ ンデム型融合蛋白質が、 下記式
    A- B - C ) η [Π a ] j y
    C-f B 一 C^-B - A [ O b ]
    C- B一 C^-A [ H e ]
    ( C - B -^A [Et a ]
    A - B- c - B^—^-C cm b ] 、 または
    A- c一 B^-^C [m c ]
    (式中、 Aはキャ リ ア一を示し、 B、 C及び nは前記に同じ） で表される請求項 2記載のぺプチ ドまたは蛋白質の製造方法。
    4. nが 2 ~ 2 0である請求項 2記載のぺプチ ド又は蛋白質の製 造方法。
    5. キャ リアーが、 ひ ーァ.ミ ラーゼ、 中性又はアルカリ性プロテ ァ一ゼ、 セルラーゼ、 3 — ラ ク タマーゼ、 3 —ガラ ク ト シダ一ゼ、 ク ロラムフ エニコ一ルァセチル ト ラ ンスフ ェラーゼ、 R e c A蛋白 質、 t r p E、 ヒ ト イ ンタ一ロイキン一 2、 ヒ ト成長ホルモ ン、 ジ ヒ ドロ葉酸還元酵素、 プロテイ ン A、 λ c I I 、 アルカ リ フ ォ スフ ァ ターゼ、 ぺニシリナ一ゼなどの全部又はその一.部 ； これらの誘導 体である請求項 1 または： 3記載のぺプチ ド又は蛋白質の製造方法。
    6. キャ リ ア一力《、 黄色ブ ドウ状球菌 [ス タ フイ ロコ ッカ ス ♦ ァ ウ レウス（Staphylococcus aureus) ] 由来のプロテイ ン Aである請 求項 5記載のぺプチ ド又は蛋白質の製造方法。
    7. 目的とするペプチ ド又は蛋白質が、 イ ンスリ ン、 ガス ト リ ン、 オビオノィ ドペプチ ド、 上皮細胞成長因子、 エン ドセ リ ン、 バソァ ク ティ ブ · イ ンテスティ ナル · ポリ ペプチ ド （Vasoactive Intesti nal Polypeptide ) 、 心房性利尿ホルモ ン、 サブスタ ンス P、 カル シ トニン、 イ ンシユ リ ン様成長因子 I , I I 、 ガラニン、 乇チリ ン、 バソプレ シ ンから選択された生理活性ペプチ ド ； ヒルジ ン、 ェグリ ン（：、 分泌性白血球由来プロテアーゼイ ン ヒ ビター、 ヒ ト アルブミ ン、 血液凝固因子、 リ ンフ ォ カイ ン、 神経成長因子、 肝細胞再生因 子から選択された蛋白質 ； またはこれらの前駆体である請求項 1 ま たは 2記載のぺプチ ド又は蛋白質の製造方法。
    8. ペプチ ドが、 下記のア ミ ノ酸配列で表される V I P J駆体で ある請求項 7記載のぺプチ ド又は蛋白質の製造方法。
    H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg- Leu - Arg - Lys - Gl n - Met - Al a - VaKys - Lys - Tyr - Leu - Asn - Ser - I le-Leu-Asn-Gly-X
    (式中、 Xは、 O H、 L y s - O H、 A r g— O H、' L y s — A r g— O H、 または A r g - L y s — O Hを示す）
    9. ジペプチ ドが、 L y s — A r g、 または A r g— A r gであ る請求項 1または 2記載のぺプチ ド又は蛋白質の製造方法。
    1 0. プロテアーゼと、 ジペプチ ド鎖の N末端側から塩基性アミ ノ酸を特異的に遊離するァ ミ ノべプチダ一ゼ及び/又はジペプチ ド 鎖の C末端側から塩基性ァ ミ ノ酸を特異的に遊離するカルボキシぺ プチダーゼとを作用させる請求項 1 または 2記載のぺプチ ド又は蛋 白質の製造方法。
    1 1. プロテアーゼが、 ジペプチ ド鎖の C末端側を特異的に加水 分解する、 I R C M—セリ ンプロテアーゼ（SeMne Protease) 1、 P O M C— コ ンノく'一ティ ングェンザィム (converting enzyme) 、 酵 母サッカロマイセス属 (Saccharomyces) 、 クライべロマイセス属 ( K 1 uy veromyces) 、 スポロボ rマイセス属 (Sporobolomyces) 、 フィ 口 ジジゥム属 C Fi lobasidium) 、 ノヽンゼヌラ属 (Hansenu 1 a) 、 ィサチェ ンキア属 （ Issatchenkia) 、 ピキア属 （Pichia) 、 ロ ド スポリ ジゥム属 （Rhodosporidium) 、 サッカロ ミ コプシス属 （Sacc haromycopsis) 由来の少なく と，も一種のプ口テアーゼである請求項
    I、 2または 1 0記載のぺプチ ド又は蛋白質の製造方法。
    1 2. プロテアーゼが、 酵母由来の塩基性ア ミ ノ酸残基対特異的 プロテアーゼである請求項 1 1記載のぺプチ ド又は蛋白質の製造方 法 o
    1 3. ア ミ ノぺプチダ一ゼが、 ア ミ ノぺプチダーゼ B (E . C . 3.4.
    II.6) である請求項 1 0記載のぺプチ ド又は蛋白質の製造方法。
    1 4. カルボキシぺプチダ一ゼが、 カルボキシぺプチダーゼ B (ト: . C . 3.4.17.2) 、 カルボキシぺプチダーゼ E (エンケフ ア リ ン · コ ンベルタ一ゼ） 、 カルボキシぺプチダーゼ N (E.C. 3.4.17.3) 、 及 び yscaの少な,く と も一種である請求項 1 0記載のペプチ ド又は蛋 白質の製造方法。
    1 5. 宿主微生物が、 酵母、 カ ビ、 ェシ リ ヒア （Escherichia) 厲、 バチルス （Bacil lus) 属、 又はスタフイ ロコ ッカス （Staphylo coccus) 属微生物である請求項 1または 2記載のぺプチ ド又は蛋白 質の製造方法。
    1 6. バチルス属の微生物が、 バチルス ♦ ズプチ リ ス (Bacillus subtil^s) である請求項 1 5記載のぺプチ ド又は蛋白質の製造方 法 o
    1 7. 融合蛋白質にプロテア一ゼを p H 6〜 l 0、 温度 1 5 ~ 6 ' 0 で作用させる請求項 1 または 2記載のぺプチ ド又は蛋白質の製 造方法。 <
    1 8. 融合蛋白質 1 モルに対して、 プロテアーゼ 0. 0 0 1 〜 1 0 0 Uを作用させる請求項 1 または 2記載のペプチ ド又は蛋白質 の製造方法。
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    CA1335966C|1995-06-20|Kex2 endoprotease and process for production thereof
    HARBECK et al.1991|Aminopeptidase P from rat brain: purification and action on bioactive peptides
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    US20190031710A1|2019-01-31|Peptide fragment condensation and cyclisation using a subtilisin variant with improved synthesis over hydrolysis ratio
    Barbero et al.1986|Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila
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    KR100627590B1|2006-09-25|보조 펩타이드를 사용하는 펩타이드의 제조방법
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US5506120A|1996-04-09|
    EP0591524A1|1994-04-13|
    JPH04148694A|1992-05-21|
    CA2070781A1|1992-04-10|
    EP0591524A4|1994-08-03|
    JPH07108232B2|1995-11-22|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    JPS56166200A|1980-02-29|1981-12-21|Univ California|Idiosyncratically cutting linker|
    JPS61268193A|1985-03-28|1986-11-27|Chiron Corp|Production of polypeptide|
    JPH01191683A|1988-01-27|1989-08-01|M D Res Kk|Novel protease|
    JPH01199578A|1988-02-03|1989-08-10|Matsuo Toshiyuki|Kex2 endoprotease and production thereof|US5763284A|1994-04-29|1998-06-09|Dade International Inc.|Methods for peptide synthesis and purification|
    US6204008B1|1995-04-11|2001-03-20|Merck & Co., Inc.|Bioprocess for production of dipeptide based compounds|
    US6265204B1|1997-01-17|2001-07-24|Genencor International, Inc.|DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides for secretion of polypeptides in filamentous fungi|NL7811041A|1977-11-08|1979-05-10|Genentech Inc|Verbeterde werkwijze en middel voor het tot uitdrukking brengen van microbieel polypeptide.|
    SE8300693L|1983-02-09|1984-08-10|Sven Lofdahl|Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta|
    US4703004A|1984-01-24|1987-10-27|Immunex Corporation|Synthesis of protein with an identification peptide|
    CA1213537A|1984-05-01|1986-11-04|Canadian Patents And Development Limited - Societe Canadienne Des Brevets Et D'exploitation Limitee|Polypeptide expression method|
    US4828994A|1984-09-21|1989-05-09|Genex Corporation|Bacillus strains with reduced extracellular protease levels|
    JP2862870B2|1986-09-12|1999-03-03|協和醗酵工業株式会社|新規ペプチド|
    DE3851117T2|1987-10-16|1995-03-30|Genencor Int|Sequenzspezifische saure E.coli-Protease.|
    EP0336056B1|1988-01-27|1995-04-05|M &amp; D RESEARCH CO., LTD.|Protease|
    JPH0578306B2|1988-08-12|1993-10-28|Md Res||
    JPH0587265B2|1989-04-13|1993-12-16|Suzuki Musical Instr Mfg||US5612198A|1990-09-04|1997-03-18|The Salk Institute|Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells|
    EP0548267A4|1990-09-04|1994-11-23|Salk Inst Biotech Ind|Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells|
    DE69232666T2|1991-04-01|2003-03-20|Merck & Co Inc|Gene, die die proteolytische aktivitaet von pichia beeinflussen und deren verwendung|
    FR2701953B1|1993-02-22|1995-05-24|Centre Nat Rech Scient|Protéine de fusion multi-VIP et procédé de préparation de VIP recombinant.|
    EP0645454A3|1993-06-22|1997-01-15|Vladimir Glebovich Lunin|Chimeric somatostatin containing protein and coding DNA, immunogenic compositions and method for increasing farm animal productivity.|
    US6037145A|1994-09-07|2000-03-14|Suntory Limited|Process for production of protein|
    WO1996034958A1|1995-05-03|1996-11-07|Biostar Inc.|Vasoactive intestinal peptide|
    US6037321A|1995-05-03|2000-03-14|Biostar Inc.|Fusion proteins comprising vasoactive intestinal peptide or PACAP|
    WO1997001627A1|1995-06-27|1997-01-16|Igen International, Inc.|High-level expression and efficient recovery of ubiquitin fusion proteins from escherichia coli|
    GB9513967D0|1995-07-08|1995-09-06|Univ Leicester|Insulin|
    WO1997014426A1|1995-10-20|1997-04-24|University Of Nebraska Board Of Regents|Compositions and methods for enhancing immune responses mediated by antigen-presenting cells|
    US20080286228A1|1995-10-20|2008-11-20|Tarantolo Stefano R|Compositions and methods for enhancing immune responses mediated by antigen-presenting cells|
    GB9526733D0|1995-12-30|1996-02-28|Delta Biotechnology Ltd|Fusion proteins|
    US5935824A|1996-01-31|1999-08-10|Technologene, Inc.|Protein expression system|
    CA2198966C|1996-03-04|2011-06-21|Yuji Suzuki|Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme|
    GB9716790D0|1997-08-07|1997-10-15|Creative Peptides Sweden Ab|Recombinant DNA molecules comprising multimeric copies of a gene sequence and expression thereof|
    KR100368073B1|1999-03-09|2003-01-24|한국생명공학연구원|융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법|
    WO2001079271A1|2000-04-12|2001-10-25|Principia Pharmaceutical Corporation|Albumin fusion proteins|
    US7507413B2|2001-04-12|2009-03-24|Human Genome Sciences, Inc.|Albumin fusion proteins|
    WO2003059934A2|2001-12-21|2003-07-24|Human Genome Sciences, Inc.|Albumin fusion proteins|
    ES2500918T3|2001-12-21|2014-10-01|Human Genome Sciences, Inc.|Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta|
    US20080194481A1|2001-12-21|2008-08-14|Human Genome Sciences, Inc.|Albumin Fusion Proteins|
    EP1501935B1|2002-04-22|2009-09-23|Dow Global Technologies Inc|Low-cost production of peptides|
    AT480624T|2002-06-29|2010-09-15|Korea Res Inst Of Bioscience|Yapsin-mangelmutantenstamm von hansenula polymorpha sowie verfahren zur herstellung rekombinanter proteine damit|
    SI1583562T1|2003-01-06|2011-10-28|Angiochem Inc|AngioPep-1, sorodne spojine in njihove uporabe|
    RU2395582C2|2003-09-30|2010-07-27|Асубио Фарма Ко., Лтд.|СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВАРИАНТА ПРОТЕАЗЫ ОmpТ|
    CA2554089C|2004-02-09|2013-10-22|Human Genome Sciences, Inc.|Albumin fusion proteins|
    US9365634B2|2007-05-29|2016-06-14|Angiochem Inc.|Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues|
    US20130172274A1|2005-12-20|2013-07-04|Duke University|Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties|
    US8334365B2|2006-06-07|2012-12-18|Human Genome Sciences, Inc.|Albumin fusion proteins|
    US8178495B2|2008-06-27|2012-05-15|Duke University|Therapeutic agents comprising a GLP-1 receptor agonist and elastin-like peptide|
    CN102245642A|2008-10-15|2011-11-16|安吉奥开米公司|Glp-1激动剂的结合物及其用途|
    SG10201407329RA|2009-08-14|2015-01-29|Phasebio Pharmaceuticals Inc|Modified vasoactive intestinal peptides|
    CA2976038A1|2015-02-09|2016-08-18|Phasebio Pharmaceuticals, Inc.|Methods and compositions for treating muscle disease and disorders|
    AU2018238302A1|2017-03-20|2019-10-24|Lupin Limited|Expression and large-scale production of peptides|
    法律状态:
    1992-04-16| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CH DE FR GB SE |
    1992-04-16| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CA US |
    1992-06-05| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1991904654 Country of ref document: EP |
    1992-06-08| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 2070781 Country of ref document: CA |
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    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2/271880||1990-10-09||
    JP2271880A|JPH07108232B2|1990-10-09|1990-10-09|ペプチド又は蛋白質の製造方法|EP19910904654| EP0591524A4|1990-10-09|1991-02-25||
    US08/243,082| US5506120A|1990-10-09|1994-05-16|Method of producing peptides or proteins as fusion proteins|
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